ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）試劑盒是臨床檢驗(yàn)、科研領(lǐng)域常用的免疫定量檢測(cè)工具，可精準(zhǔn)檢測(cè)樣本中的抗原、抗體、細(xì)胞因子等目標(biāo)物質(zhì)，其通用操作規(guī)范如下：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
提前20~30分鐘將試劑盒從2~8℃冷藏環(huán)境取出平衡至室溫，避免溫度差導(dǎo)致反應(yīng)偏差。首先處理樣本：血清、血漿樣本需離心去除雜質(zhì)；組織樣本需勻漿后離心取上清；細(xì)胞上清需先去除懸浮細(xì)胞，若目標(biāo)物濃度過高需按說明書要求做梯度稀釋。隨后復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品：將凍干標(biāo)準(zhǔn)品按標(biāo)注量加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，輕輕混勻后靜置10min，再按濃度梯度做系列稀釋用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。接著配制洗滌液：將濃縮洗滌液用去離子水按比例稀釋（一般1:20~1:30，以說明書為準(zhǔn)），現(xiàn)配現(xiàn)用；TMB底物液需現(xiàn)配并全程避光保存。最后提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，校準(zhǔn)移液器，準(zhǔn)備潔凈無殘留的酶標(biāo)板，市售試劑盒多為預(yù)包被板可直接使用，若為空白包被板需先完成抗體包被步驟。
二、elisa試劑盒操作方法的具體流程
1.加樣孵育：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔，空白孔僅加對(duì)應(yīng)稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔加入100μL處理后的待測(cè)樣本，加樣時(shí)槍頭避免觸碰孔壁防止交叉污染，加樣后輕輕晃動(dòng)板孔混勻，用封板膜封閉后放入37℃恒溫箱孵育1~2h（部分試劑盒需4℃過夜孵育，以說明書為準(zhǔn)）。
2.洗板：棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液沖洗每孔3~5次，每次停留30s~1min，最后在干凈濾紙上拍干孔內(nèi)殘留液體，注意不要用濾紙擦拭孔壁，避免孔板吸附雜質(zhì)導(dǎo)致背景過高。
3.加檢測(cè)體系：按說明書要求先后加入稀釋后的檢測(cè)抗體、酶標(biāo)二抗，每孔加樣100μL，封閉后孵育30~60min，再次按上述方法洗板3~5次，拍干。
4.顯色終止：每孔加入100μLTMB底物液，避光孵育10~30min，待標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯梯度顯色后，每孔加入50μL終止液，液體隨即由藍(lán)色變?yōu)辄S色。
5.數(shù)據(jù)采集：用酶標(biāo)儀在450nm波長下檢測(cè)各孔OD值，若有背景干擾可設(shè)置雙波長630nm扣除空白本底。
三、結(jié)果判定
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合或線性回歸計(jì)算回歸方程，將樣本孔OD值代入方程得到目標(biāo)物濃度，再乘以樣本稀釋倍數(shù)即為最終檢測(cè)結(jié)果。
四、注意事項(xiàng)
操作時(shí)需嚴(yán)格遵循對(duì)應(yīng)試劑盒的說明書要求，不同批次試劑嚴(yán)禁混用；洗滌液、底物液需現(xiàn)配現(xiàn)用，酶結(jié)合物、終止液避免強(qiáng)光直射；若樣本出現(xiàn)溶血、脂血等情況需重新取樣，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
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